Действие непрерывного и модулированного ультразвука на нейроны рыб

Пашовкин Тимофей Николаевич ORCID: 0000-0001-9697-9230 доктор биологических наук ведущий научный сотрудник; Институт биофизики клетки Российской академии наук - обособленное подразделение ФИЦ ПНЦБИ РАН 142290, Россия, Московская область, г. Пущино, пр-т Науки, 29, кв. 48 Pashovkin Timofei Nikolaevich Doctor of Biology Leading Researcher; Institute of Cell Biophysics of the Russian Academy of Sciences - a separate division of the FITC PNCBI RAS 29 Nauki ave., 48 sq., Pushchino, Moscow region, 142290, Russia pashovkin@mail.ru Другие публикации этого автора

Садикова Диана Габдельфартовна кандидат физико-математических наук Научный сотрудник; Институт биофизики клетки РАН - обособленное предприятие ФИЦ ПНЦБИ РАН 142290, Россия, г. Пущино, Студенческий пер., 16, кв. 54 Sadikova Diana Gablel'fartovna PhD in Physics and Mathematics Researcher; Institute of Cell Biophysics of the Russian Academy of Sciences - a separate enterprise of the FITC PNCBI RAS 142290, Russia, Pushchino, Studentskiy lane, 16, sq. 54 sdg7@list.ru

Введение.

Любые воздействия, приводящие к изменению электрической активности нейронов, занимают центральное место в фундаментальных исследованиях и важны для клинического лечения неврологических расстройств. У модельных животных и людей визуализация изменений активности как отдельных нейронов, так и нейронной активности в масштабе целого мозга является основным способом развития нейробиологических технологий. Имеющиеся электрические и оптические методы, как правило, не работают в этом масштабе из-за присущих им физических ограничений. Альтернативой этих методов является применение ультразвука, который взаимодействует с тканями мозга с фундаментальным разрешением порядка 100 мкм и временным разрешением - 1 мс. В настоящее время интенсивно развивается транскраниальная ультразвуковая стимуляция (ТУС) как новый, неинвазивный метод нейромодуляции ^[3]. ТУС имеет более высокое пространственное разрешение, чем транскраниальная магнитная стимуляции (ТМС) ^[1] или стимуляция постоянным электрическим током ^[2], которые используются на практике в настоящее время.

Почти сто лет назад впервые было признано, что ультразвук модулирует электрическую активность клеток. С тех пор в литературе широко освещалась ультразвуковая нейромодуляция в головном мозге, в периферической нервной системе людей и модельных организмов ^[3–10]. Не смотря на длительный срок исследований. фундаментальные клеточные, молекулярные и механические основы ультразвуковой нейромодуляции до сих пор остаются в значительной степени неизвестными ^[3-11]. Отмечено, что ультразвук создает возбуждающие ^[12,13] и/или тормозящие эффекты ^[14.15] в зависимости от исследуемой системы и параметров стимула ^{[3, 13, 14]}. Так, стимуляция моторной коры головного мозга у животных может индуцировать электромиографические (ЭМГ) сигналы в соответствующих мышцах передней конечности, задней конечности или хвоста, что указывает на возможность ТУС индуцировать потенциалы действия ^[15.16]. Ингибирующие эффекты TУС проявляются в долгосрочном ослаблении синаптической передачи ^[17]. Считается, что эти противоположные действия на активность нейронов обусловлены различиями в месте стимуляции, интенсивности, частоте ультразвука и других параметрах ^{[18, 28]}.

Ультразвук может оказывать комбинрованное тепловое и механическое воздействие на нейроны ^{[19, 20]}. Тепловые и кавитационные эффекты ультразвука, хотя эффективно используются для разрушения ткани или для временного открытия гематоэнцефалического барьера ^[21], требуют использования большей мощности, частоты и / или продолжительности воздействия, чем обычно используемые для нейромодуляции ^[3]. За счет сжатия и расширения в ультразвуковой волне в клеточных мембранах могут возникать неселективные токи, изменяющие электрическую активность клеток ^[3,11]. За счет создания сдвиговых напряжений в клеточной мембране, увеличивающих натяжение мембраны и появления геометрической деформации липидного бислоя, ультразвук может активировать механочувствительные ионные каналы ^{[3, 13, 20-26]}.

Ультразвук может оказывать как тепловое, так и механическое воздействие на область исследований в тканях мозга. Однако, повышение температуры будет незначительным при низких интенсивностях ультразвука ^[27], а силы акустического излучения оказывают механическое воздействие, не вызывая кавитации ^[13]. С позиции биофизики механочувствительные каналы реагируют на механическое воздействие ультразвука ^[28]. Например, изменения проводимости каналов могут быть связаны с изменениями формы каналов. Ультразвук может это сделать за счет появления сдвиговых напряжений в мембранах, либо за счет изменения натяжения мембраны при изменении давления в ультразвуковой волне. Эти изменения расширяют канал и делают его более цилиндрическим в плоскости мембраны при открытии ^[28]. Они энергетически благоприятны при наличии натяжения мембраны, и это приводит к зависящей от натяжения разнице энергий между состояниями, которая способствует открытию канала ^[29,30].

В лабораторных условиях использование модулированных ультразвуковых волн может позволить выделить нейронные структуры, дающие частотно-зависимый ответ на внешнее периодическое воздействие, выделить частоты, при которых изменения функциональной активности будут максимальными.

Также, в нейробиологических исследованиях важным является выбор объекта. В этом отношении удобным объектом служат Маутнеровские нейроны (МН) костистых рыб и амфибий. Они имеют значительное количество афферентных входов и контролируют плавательную активность рыб, управляя движением хвостового плавника, инициируя унилатеральный удар хвостового плавника, главного движителя рыб. Это позволяет судить о функциональных изменениях в нейронах по поведению животного и направленно влиять на него различными экспериментальными воздействиями. МН представляют собой две гигантские клетки в продолговатом мозге большинства костистых рыб и личинок амфибий. Они иннервируются из вестибулярного аппарата через VIII нерв (Рис.1). В свою очередь МН контралатерально иннервирует спинальные мотонейроны, которые управляют мускулатурой туловища. Эта точка зрения была подтверждена многочисленными экспериментальными данными ^[31-36].

Рис. 1. Схема расположения Маутнеровских нейронов у рыб.

Одним из аспектов применения ультразвука является индуцирование быстрых функциональных изменений при условии минимального проявления неспецифических реакций нервной ткани. Наличие характерных частот в электрической активности нейронов позволяет предположить, что воздействие импульсно-модулированным ультразвуком с соответствующими частотами следования импульсов может вызвать частотно зависимые изменения в функциональном состоянии этой ткани.

При применении ультразвука, как правило, в области воздействия находится значительное количество различных нервных окончаний. В случае изменения их функционирования при воздействии можно предположить, что в различной степени могут изменяться и различные биохимические процессы в органах и тканях, иннервируемых этими окончаниями и, следовательно, их функциональное состояние. Наиболее явно это может проявиться при воздействии на идентифицированные, специализированные нейроны, отвечающие за определенные функциональные состояния органа, ткани, организма в целом.

Целью работы является исследование действия непрерывного и импульсно модулированного ультразвука на морфофункциональное состояние нейронов головного мозга и идентифицированных центральных нейронов позвоночных – маутнеровских нейронов золотых рыбок. Приоритетная цель работы – получение спектров действия для нейронов. Но для их получения необходимо знать, как воздействует на нейроны непрерывный ультразвук, так как он используется как фактор с несущей частотой, на которую накладываются частоты модуляции. Поэтому конечный эффект это суммарный эффект непрерывного ультразвука и и модуляционных частот.

Материалы и методы.

Оценку активности нейронов мозга и функционально активности МН проводили по поведению рыбок в кольцевой камере ^[31], подсчитывая в течение 10 мин число секторов и поворотов, инициируемых активацией МН. Кольцевая камера состояла из кругового канала шириной 20 мм и высотой уровня воды 30 мм. Дно камеры было разделено на 8 секторов. В данной камере рыбка передвигается по кругу, периодически меняя направление движения, делая повороты. Таким образом, измеряли количественно скорость ее движения, и частоту поворотов. Пере5движение рыбки по кольцу и повороты рыбок являются стандартной двигательной реакцией рыб. Тест двигательной активности состоял в том, что рыбка помещалась в камеру, и измеряли число пройденных секторов и частоту совершенных поворотов или смен направлений движения. Тестирование во всех экспериментах проводили в течение 10 минут в одно и то же время, так как двигательная активность рыб зависит от времени суток, в которое проводится тестирование.

Облучение МН золотых рыбок проводилось на отдельной установке, блок-схему которой приведена на рис. 3, используя фокусирующий ультразвуковой излучатель, подключенный к терапевтическому генератору УЗТ-1.01Ф с несущей частотой 0.88 МГц средней по пространству и времени интенсивностью в диапазоне 0.1 – 1 Вт/см². Зона облучения головы рыбы находилась в центральной части фокальной области, длиной 1 см и радиусом фокального пятна 2.5 мм. Интенсивность ультразвука оценивали с помощью дифференциальной термопары, калиброванной по интенсивности ультразвука. Пространственное распределение интенсивностей в фокальной области определяли методом краска/бумага, представляемого в виде 2-х и 3-х мерного изображения (рис.2). Общее время облучения изменяли в диапазоне от 15 сек до 20 мин. В качестве модулятора был использован генератор Г6-28. Рыба была зафиксирована в специальной термостатируемой камере на расстоянии 7 см от поверхности излучателя. (Рис. 3)

А Б

Рис.2. Визуализация распределений интенсивностей ультразвука в фокальной области излучателя. А - двумерное изображение, Б – трехмерное изображение, где Z шкала интенсивностей ультразвука, Вт/см².

Рис. 3. Блок-схема установки для воздействия ультразвуком на нейроны рыб.

1. Генератор ультразвука, 2 – осциллограф, 3 - реле времени, 4 – излучатель, 5 - внешняя камера, 6 - внутренняя камера, 7 - объект (рыба), 8 – термостат, 9 - индикатор фокуса, 10 - область облучения.

Озвучивание проводили при температуре 18 ^оС. Температура в камере измерялась перед облучением и непосредственно после него. Эффективность термостатирования была не хуже 18+ 0.3 ^оС.

Морфологические изменения в МН были исследованы с помощью электронного микроскопа JEM-100B после стандартной процедуры фиксации ультратонких срезов нервной ткани ^[32].

Результаты исследований и обсуждение.

На рис. 4 показаны изменения двигательной активности рыб под действием непрерывного ультразвука интенсивностью 0.1 Вт/см². На рисунке видно стимулирующее действие ультразвука низких интенсивностей.

На рис. 5 показано угнетение двигательной активности рыб под действием ультразвука интенсивностью 1.0 Вт/см². Это угнетение обратимо, и исчезает: через 10 минут после озвучивания в течение 30 сек, и через 30-40 минут после озвучивания в течение 5 минут. Угнетение активности становится необратимым после 20 минут озвучивания, с летальным исходом.

Рис.4. Стимуляция поворотной реакции рыб (реакция Маутнеровского нейрона) в зависимости от времени воздействия ультразвуком малых интенсивностей: I_SATA = 0,1 Вт/см², f = 0.88 МГц, t = 18 ^oC, 100 % - контрольный уровень.

После подавления ультразвуком с интенсивностью 1 Вт/см² и временем воздействия 5 минут, наблюдается быстрое восстановление функциональной активности рыб при следующим за ним ультразвуковым воздействием с интенсивностью 0.1 Вт/см², проводимым в течение 5 минут.

На рис 6 показано изменение двигательной активности рыб относительно величины эффекта непрерывного ультразвука, под действием амплитудно-модулированного ультразвука в диапазоне частот модуляции 2 – 14 Гц, скважностью 2, глубиной модуляции 100 %, времени облучения – 5 мин.

а

б

Рис. 5. Зависимость плавательной активности рыб от времени воздействия непрерывным ультразвуком: а) угнетение плавательной активности, б) угнетение поворотной реакции, А) область высокой смертности рыб (более 90 %). I_SATA = 1 Вт/см², f = 0.88 МГц, t = 18 ^оС

Видно (см. рис. 6а,б), что максимальное угнетение двигательной активности наблюдается при частотах модуляции 6 и 10 Гц, и максимальная активация - при частоте модуляции – 8 Гц. Причем, в более значительной степени изменяется поворотная реакция рыб, в то время как общая двигательная реакция изменяется таким же образом, но с меньшей амплитудой. Отсюда следует, что идентифицированный МН в более значительной степени подвержен действию амплитудно-модулированного ультразвука, чем совокупность остальных нейронных структур. Функциональные ответы на воздействие ультразвука с указанными частотами модуляции являются характерными как для отдельных специфических нейронов, так и для системы нейронов в целом. Спектры действия приведены с учетом эффектов несущей частоты (эти эффекты вычтены из спектра). Причем, активационные эффекты, вызванные частотой модуляции 8 Гц, отменялись частотой 10 Гц, при равноэнергетическом воздействии. На этом примере можно видеть возможность стабилизации функционального состояния Маутнеровского нейрона рыб за счет использования только лишь модуляционных режимов ультразвукового воздействия.

Ультраструктурный анализ электронно-микроскопических изображений показал, что по сравнению с нормой (рис.7) озвучивание МН ультразвуком интенсивностью 1 Вт/см² в течение времени от 10 до 20 минут приводит к деструктивным изменениям в ультраструктуре МН, выражающимся в расслоении миелиновой оболочки и разрывах в аксолемме. Это сопровождается также полным запустеванием аксосоматических синапсов и общим уменьшением синаптических везикул. Эти морфологические изменения коррелируют с поведением золотых рыбок в кольцевой камере, связанным с уменьшением функциональной активности МН после воздействия ультразвуком, интенсивностью 1 Вт/см². Ультразвук не вызывает видимых изменений в миелиновой оболочке или аксолеммах пресинаптических волокон при воздействии в течение 5 минут (интенсивность ультразвука – средняя по пространству и времени – ISATА), однако вызывает изменение в цитоплазме МН. Эти изменения заключаются в образовании кристаллоподобных структур внутри ядра (рис.8). Подобные изменения наблюдаются и при воздействии импульсно-модулированного ультразвука с частотами модуляции 6 и 10 Гц. Кристаллоподобные структуры образуются за счет перегруппировки нейрофиламентов, имеющихся в цитоплазме.

А

Б

Рис. 6. Зависимость изменения двигательной активности золотых рыбок под действием модулированного ультразвука от частоты модуляции: А) поворотной реакции, Б) общей двигательной активности. I_SATA = 0.35 Вт/см² (1/2 интенсивности непрерывного ультразвука = 0.7 Вт/см² – скважность = 2) , f = 0.88 МГц , t = 5 мин.

Рис. 7. Структура тканей мозга золотых рыбок до ультразвукового воздействия. а) миелиновая оболочка.

Рис. 8. Образование нейрофиламентарных пучков в тканях мозга золотых рыбок после ультразвукового воздействия: а) нейрофиламентарные пучки. I_SATA =1 Вт/см², f = 0.88 МГц, t = 5 мин.

Существенным фактом для терапии является то, что озвучивание рыб ультразвуком низкой терапевтической интенсивности 0.1 Вт/см² приводит к восстановлению структурной организации нейронов и рассасыванию нейрофиламентарных пучков.

Эффекты непрерывного ультразвука зависят преимущественно от механизмов биологического действия (механических, тепловых, кавитационных). При увеличении интенсивности воздействия преимущественно работает один из этих механизмов. Как правило, с увеличением интенсивности наблюдается подавление функционального состояния нейронов, коррелирующее с морфологическими изменениями в структурах нейронов.

Одной из мишеней модулированного ультразвукового воздействия могут быть механочувствительные ионные каналы различного типа. Так, их активация может быть за счет увеличения натяжения клеточной мембраны или геометрической деформации липидного бислоя. К таким каналам могут относиться механочувствительные ионные каналы (K2Ps), Piezo1, MEC-4, TRPA1, Msc, и управляемые напряжением Na⁺ и Ca²⁺ каналы. На сегодняшний день точно неизвестно, как ультразвук влияет на активность этих каналов.

Эффекты модулированного ультразвука на нейронах могут существенно отличаться от эффектов непрерывного ультразвука. Наличие активных частот приводит к трансформации биологических эффектов. На частотах активации или подавления функциональной активности можно получить эффекты, превышающие по амплитуде эффекты непрерывного ультразвука, с возможностью изменения знака эффекта при изменении интенсивности. Из приведенных в статье данных видно, что при воздействии модулированного ультразвука с равными энергетическими параметрами можно получать частотно-зависимые эффекты стимуляции и подавления активности нейронов при существенно меньших энергиях в ультразвуковом пучке, чем при воздействии непрерывного ультразвука. Таким образом, можно существенно снизить интенсивность ультразвукового воздействия в физиотерапии с сохранением величины биологических эффектов при использовании модулированных ультразвуковых полей. Показана возможность управления модулированным ультразвуком функциональным состоянием нейронов, используя для коррекции различные части спектров действия, полученных как для отдельных нейронов, так и для сложных структур нейронов рыб.

Выводы.

1. Для нейронов рыб показаны временные диапазоны формирования эффектов стимуляции при интенсивности ультразвука меньше 0.1 Вт/см² и эффектов угнетения двигательной активности рыбок при интенсивности 1 Вт/см².

2. Показано возможность восстановления функциональной активности рыбок с помощью стимуляции ультразвуком интенсивностью 0.1 Вт/см² сразу после угнетающего воздействия ультразвуком интенсивностью 0.7 - 1.0 Вт/см².

3. Впервые показаны акустические спектры действия в диапазоне частот модуляции 2-14 Гц для нейронов головного мозга рыб, включая идентифицированные Маутнеровские нейроны.

4. Показана возможность снижения риска ультразвукового негативного воздействия с сохранением величины биологического эффекта при использовании модулированного ультразвука.

5. Впервые показана возможность управления знаком биологического эффекта на нейронах рыб с использованием равноэнергетического воздействия модулированным ультразвуком.